单分子水平的实时荧光多重检测可以揭示混合物和其他复杂样品中多种分子种类的化学计量、动力学和相互作用。然而，由于信噪比低、光谱重叠高以及需要保持染料的化学相容性，基于荧光的传感通常仅限于一次检测3-4种颜色。为了克服这一限制，单分子荧光多重技术利用额外的测量维度来分离信号。其中，在DNA纳米结构上精准定位数量有限的荧光团间的荧光共振能量转移(FRET)可决定荧光亮度和量子产率、荧光寿命等光谱特性，为单分子荧光多重检测提供更多可能性。

近期，芝加哥大学的研究团队在《Nature Nanotechnology》期刊上发表了题为“Single-molecule fluorescence multiplexing by multi-parameter spectroscopic detection of nanostructured FRET labels”的研究文章。该研究开发了由几十个称为FRETfluors的复合荧光标签集合，成功用于高度精准的单分子多重检测。

FRETfluors由三种化学成分（DNA、Cy3和Cy5）构成致密纳米结构，该结构可通过改变几何形状、荧光团附着化学和DNA序列来调控光谱特性。利用反布朗运动电动力（ABEL）阱进行FRETfluors多参数测量（亮度、荧光寿命和FRET效率），光谱参数差异分析显示出不同团簇，从而对单个FRETfluors进行分类和识别。通过分析41个FRETfluors所有成对组合，排除可能引起分类错误的FRETfluors，最终确定了27个适合在单一混合物中使用的FRETfluor集合。对FRETfluors的DNA序列进行常见化学连接编程，可实现对多种类型生物标志物的特异性标记。结合ABEL阱成功对复杂混合物中FRETfluors标记的低浓度（＜100 fM）dsDNA、mRNA、蛋白质进行免洗多重检测。

FRETfluor设计利用染料光物理的特定位点可调性作为额外的测量维度，以最少的化学构件来补充和组合扩展FRET的多重标记能力。该设计策略在其他纳米结构和荧光团组合上具有通用性，可进一步扩大FRETfluor集合数量，为多重检测提供强大的标记工具。

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41565-024-01672-8

注：此研究成果摘自《Nature Nanotechnology》杂志，文章内容不代表本网站观点和立场，仅供参考。