基于CRISPR–Cas13a的直接RNA检测技术因无需逆转录和DNA扩增而受到广泛关注，但这些检测不易在同一反应中检测多种病毒或变异株，通常需要将样本分到多个反应体系中，影响了其在感染性疾病多靶标同时诊断中的实用性。因此，开发一种简单、快速、无需分样就能实现高通量多重RNA检测的新方法，是当前诊断技术发展中的重要课题。

近日，由美国加州大学伯克利分校和韩国科学技术院领衔的国际合作研究团队在《Nature Biomedical Engineering》上发表了题为"Programmable kinetic barcoding for multiplexed RNA detection with Cas13a"的研究论文。该研究提出并验证了一种名为“动力学条形码”（kinetic barcoding）的全新策略，通过单次液滴反应即可实现对多种呼吸道病毒及其变异株的并行检测。研究旨在利用Cas13a酶在不同靶标RNA-向导RNA组合下单分子水平的动力学差异，构建一套无需多色荧光标记、无需分样、无需DNA扩增的快速多重检测工作流，解决现有CRISPR诊断平台在多重检测通量方面的“瓶颈”问题。

研究团队的突破建立在两个关键发现之上。首先，研究发现在液滴中隔离单分子Cas13a反应后，Cas13a的核酸酶活性表现出依赖于特定靶标RNA与crRNA相互作用的可变动力学特征——不同靶标组合在30分钟内产生可区分的荧光信号斜率、波动性和反应启动延迟时间。基于这一观测，团队开发了一种crRNA修饰策略：在crRNA的5′端引入不同长度和序列的单链DNA片段，即“可编程的igRNA”，实现对Cas13a反式切割速率的系统性调控，为不同病毒或变异株生成可编程且高度可区分的动力学签名。分子动力学模拟进一步揭示，DNA效应子会快速靠近Cas13a的HEPN活性位点并占据空间，其占据比例随DNA长度增加而升高，从而解释了动力学调控具有可编程性的分子机制。

在此基础上，研究团队在15例临床样本中对该策略进行了验证。在混合多种igRNA的反应体系中，该方法成功在终点成像中获得了线性分离的荧光斜率分布，基于核密度估计和均方根比较，在无需多色荧光标记的单管反应中准确区分了SARS-CoV-2野生型、Delta变异株与Omicron变异株。研究还发现，当阳性液滴数达到20个以上时，仅需10分钟即可实现可靠的靶标鉴别。这一表现充分验证了动力学条形码策略在真实临床场景下的可行性与优越性。

该研究首次将Cas13a的单酶动力学差异作为多重检测的信息维度，结合液滴微流控和可编程igRNA，实现了无扩增、单管、快速的多重RNA检测。这一方法无需逆转录、无需多色荧光标记、无需分样检测即可在同一反应体系中区分多种病毒和变异株，为现场快速诊断提供了一种全新的技术范式。凭借其简便性、快速性和可编程扩展能力，这一策略未来有望在传染病暴发监测、基层医疗机构病原体筛查以及变异株追踪等领域发挥重要作用。研究参与人员指出，该方法能够通过简单的crRNA修饰扩展至更多RNA靶标，在应对新发突发传染病时的快速响应能力方面具有显著潜力。

论文链接：https://doi.org/10.1038/s41551-026-01642-6

注：此研究成果摘自《Nature Biomedical Engineering》杂志，文章内容并不代表本网站的观点和立场，仅供参考。