核酸内切酶是分子诊断和基因编辑的核心工具。其中，原核Argonaute蛋白（pAgos）因可使用短DNA作为“向导”灵活识别靶标，且无需PAM序列，受到广泛关注。然而，pAgos家族中，来自嗜热菌的TtAgo却有一个长期困扰研究者的瓶颈：它必须在65-85℃的高温下才能高效切割DNA。

近日，重庆医科大学联合勒芒大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了题为“Moderate-temperature DNA cleavage activity of TtAgo activated by dCTP/TthSSB for one-step isothermal microRNAs detection”的研究。该研究发现，小分子dCTP（脱氧胞苷三磷酸）与嗜热菌单链DNA结合蛋白TthSSB的协同作用，能够显著激活TtAgo在37-60℃范围内的DNA切割活性（提升约9.5倍），同时抑制其在65℃以上的活性。基于此，研究团队开发了名为ERCB-TtAgo的一步法等温microRNA检测平台，仅需40分钟即可实现飞摩尔级（fM）灵敏度。

机制研究表明，dCTP选择性结合TtAgo的PIWI催化口袋，通过别构效应（Allosteric Effect）增加酶的构象柔性，使其在中温下维持催化活性；TthSSB则与TtAgo直接互作，将DNA底物招募至催化中心。两者协同形成“温度开关”：中温下适度松动配合高效底物招募，实现最高切割效率；高温下结构过度失稳，活性反被抑制。NGS测序进一步证实，dCTP/TthSSB激活的是TtAgo的固有活性，并未改变其切割特异性。

基于上述机制，研究团队构建了ERCB-TtAgo一步法等温检测平台：靶标miRNA经Bst聚合酶延伸、Nt.BstNBI切刻、循环置换释放gDNA，最终累积的gDNA引导dCTP/TthSSB-TtAgo切割荧光探针，产生实时信号。整个过程在55℃恒温封闭运行，约40分钟完成。在灵敏度方面，最低检测限低至10 fM，较传统两步法（10 pM）提高1000倍，较单独EXPAR（1 pM）提高100倍。在检测速度方面，该平台全程仅需40分钟即可完成全流程，相比传统两步法（>2小时，含温度切换步骤）用时缩短超过3倍。在特异性方面，dCTP/TthSSB的协同作用显著抑制了EXPAR体系中常见的非特异性扩增问题。在操作便捷性方面，平台真正实现了一步法、全流程封闭检测，避免了传统两步法中开管转移带来的交叉污染风险。在与同类中温酶对比方面，dCTP/TthSSB辅助的TtAgo在55℃下催化效率较CbAgo高出约1680倍，5-10分钟即可完成切割。

研究团队以乙肝相关肝癌（HCC）为临床应用模型，选取7种HCC相关miRNA构建多重检测方案，并在151例临床血浆样本中进行了验证。结果显示，ERCB-TtAgo与金标准RT-qPCR表现高度一致。更具临床价值的是，该平台的诊断性能显著优于传统血清标志物。其81.6%的敏感度大幅超越AFP（48.7%）和PIVKA-II（56.6%），可作为现有标志物的有效补充，有望大幅提升早期HCC检出率。此外，该平台还具备区分单碱基差异的能力，能够精准分辨miRNA家族成员之间的细微序列差别。

该研究在理论层面揭示了dCTP与TthSSB协同调控TtAgo的分子机制，成功将TtAgo的工作温度范围从65-85℃拓宽至37-60℃。基于此构建的ERCB-TtAgo一步法等温检测平台，仅需40分钟即可实现10 fM级检测限，并显著抑制了EXPAR的非特异性扩增问题。该研究为下一代智能生物传感平台的开发提供了新范式，尤其在开发针对重大疾病早期诊断的临床检测工具方面具有重要意义。

论文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-026-74731-4

注：此研究成果摘自《Nature Communications》杂志，文章内容并不代表本网站的观点和立场，仅供参考。